随着上游细胞培养密度和表达量的增加，细胞培养液中细胞碎片和亚微米胶体比例随之增加，因此给培养液的澄清带来了新的挑战。本文主要研究了Mab1细胞培养液不同澄清方法的比较。方法包括离心后深度过滤、直接深度过滤及预处理后深层过滤。得到的结果表明预处理的使用显著提高了深层过滤的澄清效率。其中阳离子聚合物I絮凝剂预处理后减少了5倍深层过滤膜面积，HCD残留也降低了5-6倍，同时IgG的回收率也是可接受的(约98%)。使用同样的预处理方式对细胞培养密度更高的Mab2和细胞培养密度更低的Mab3两种细胞培养液进行同样方式的预处理，结果载量与HCD残留方面表现相同。但是预处理剂在提高澄清效率的同时也会给终产品中预处理剂的去除、前期预处理工艺的开发带来挑战，因此需要从工艺开发时间成本、综合经济成本、下游纯化对预处理剂的清除效率、培养液澄清效率等多因素综合考虑。
本文对Mab1发酵液的不同澄清方式进行了研究（见图1），主要包括3种策略，策略1为离心后深层过滤，深层过滤使用的滤器为两个不同厂家的次级深层滤器，策略2为预处理后进行深层过滤，预处理方式包括低pH调节、磷酸钙处理、阳离子聚合物I处理、阳离子聚合物II处理4种方式，深层过滤使用的滤器为两个不同厂家的初级深层滤器和1种复合深层滤器，策略3为初级深层过滤后进行次级深层过滤，同样比较了两个不同厂家的深层滤器。结果表明阳离子聚合物I后使用复合深层滤芯的方式能够显著提高澄清效率。
策略2中的预处理方式包括4种，第1种方式是向发酵液中加入酸，调节发酵液至不同的低pH，第2种方式是向发酵液中加入不同浓度的磷酸钙，第3种方式是向发酵液中加入不同浓度的阳离子聚合物I，第4种方式是向发酵液中加入不同浓度的阳离子聚合物II。
首先对发酵液进行不同方式的预处理，通过浊度、收率、HCP、HCD去除等结果来筛选pH和添加物的浓度，结果见图2。
浊度方面，所有的预处理方式都降低了浊度。当用低pH处理时pH越低浊度越低。当用磷酸钙和阳离子聚合物处理时，随着磷酸钙和阳离子聚合物浓度的增加浊度同样降低。收率方面，低浓度的阳离子聚合物II和pH大于4.5时收率都较高，磷酸钙处理后收率总体偏低，阳离子聚合物I处理后在收率方面没有明显损失。HCP去除方面，4种预处理方式的HCP去除效率都在0.4 log以内，正低pH条件下，pH 4.5和pH 5的HCP去除效率最高，磷酸钙浓度越低HCP去除越多，阳离子聚合物I和阳离子聚合物II的HCP去除效率都在0.1-0.2 log范围内。HCD去除方面，相比于HCP，4种预处理方式对HCD去除效果明显。在低pH条件下，pH越低HCD去除效果越好，随着磷酸钙浓度的增加HCD去除效率增加，当阳离子聚合物I的浓度大于0.037%时HCD去除效率显著增加，同时阳离子聚合物I对HCD的去除要整体好于阳离子聚合物II。
所以选择pH 4.5乙酸、75 mm磷酸钙、0.037%阳离子聚合物I、0.037%阳离子聚合物II作为4种预处理条件进行后续研究。
使用上述4种预处理方式对Mab1的发酵液进行预处理，考察处理后样品中的颗粒大小和粒径分布（见图3和表1）。阳离子聚合物I处理后的样品粒径最大，然后依次是阳离子聚合物II、磷酸钙、pH4.5乙酸处理后的样品。其中磷酸钙处理后的样品粒径分布最宽。进行粒径大小和粒径分布范围的研究目的是选择1个合适的深层滤器，由于经过这4种预处理后的样品中粒径分布基本在20-30 um之间，所以选择的深层滤器为0.5-20 um的复合深层滤器。
在选择了这个复合深层滤器后接着考察了滤器的过滤表现（见图4）。Mab1的发酵液经过4种预处理后使用这个0.5-20 um的复合深层滤器过滤，未经预处理的发酵液直接使用初级深层滤器过滤，结果压力迅速上升，压力表现最差。同样未经预处理的发酵液直接使用0.5-20 um复合深层滤器过滤，压力表现有所改善。而经过4种预处理后进行复合深层过滤的压力表现均比未经过预处理直接进行过滤的压力表现要好，其中阳离子聚合物I处理后进行复合深层过滤的压力表现最好。
接着考察了Mab1发酵液在策略2中各种澄清方式的澄清效果，分别从处理后样品的浊度、滤器的容污能力、滤器载量、收率、HCP去除、HCD去除几个方面考察（见图5和图6）。
可以看到，在使用传统的初级深层滤器过滤时，经过预处理的样品深层过滤后的浊度更好，但是滤器载量和容污能力不佳。在使用复合深层滤器时，经过预处理的样品比不经过预处理的样品无论是浊度、滤器的载量和容污能力都要好，其中阳离子聚合物I的整体表现最好，浊度为23NTU、容污能力为91，而载量为450 L/m2，这明显高于其他澄清方式。而在同样使用预处理的条件下，复合滤器比初级滤器的这些表现都要好。在收率方面，使用75 mm磷酸钙、pH4.5乙酸、0.037%阳离子聚合物II预处理后进行复合滤芯深层过滤，收率相对偏低，分别为80%、91%、92%，而使用0.037%阳离子聚合物I预处理后进行复合滤芯深层过滤的收率在97%以上。在HCP去除方面，各种方式的HCP去除效果没有明显区别，都在0.3 log以下，都不显著。在HCD去除方面，0.037%阳离子聚合物I预处理后复合深层过滤明显优于其他方式，HCD的去除接近5 log。因此在策略2中的各种发酵液澄清方式中，使用阳离子聚合物I预处理后经过复合深层滤芯过滤在HCD去除、收率、载量、浊度方面表现最好。
对3种策略的澄清效果进行整体比较，结果见图7。策略1与策略3相比，也就是离心后进行初级深层过滤与初级深层过滤后进行次级深层过滤相比，在收率、载量、HCP去除、HCD去除方面均无显著差异。而策略2种的0.037%阳离子聚合物I预处理加复合深层过滤的方式表现最好，收率和HCP去除与策略1和策略3相当，而载量提高了5-6倍，HCD的去除率也提高到5倍以上。
最后用另外两种抗体发酵液Mab2和Mab3对阳离子聚合物I加复合深层滤芯的澄清效率进行验证，Mab1、Mab2、Mab3代表3种不同细胞密度和表达量的发酵液，结果见表2和图8。在Mab1的实验中，与对照组相比，载量提高了约5倍，在Mab2和Mab3的实验中载量提高了约2倍。3种抗体的HCP去除都在0.1-0.2 log范围内，不显著并且无明显区别。而在HCD的去除中，Mab1和Mab2都在5-6 log范围内，Mab3则在2 log，这可能是由于Mab3的细胞培养密度低导致。
这种阳离子聚合物I预处理后进行复合深层过滤的澄清方式能够明显提高载量、对于HCD的去除有显著的提高、对于收率和浊度也有改善，在降低膜面积的同时提高了澄清效率，这显然是一种好的澄清方式。然而，在最终确定最佳澄清方法时，必须综合考虑所需的工艺开发时间、资金成本、消耗性成本、预处理化学品的成本、验证处理剂清除率的测试成本、易于规模化等多方面因素。
参考文献：
Sandeep R. Hadpe1, Vipin Mohite1, Solomon Alva1, Anurag S. Rathore Pretreatments for enhancing clarification efficiency of depth filtration during production of monoclonal antibody therapeutics[J]. Biotechnology Progress, 2020; 36:https://doi.org/10.1002/btpr.2996
