抗体偶联药物（ADC）由单克隆抗体通过连接子（linker）与小分子细胞毒素偶联形成。其中抗体可以特异性地与肿瘤细胞表面抗原结合，通过细胞内吞作用使ADC药物进入肿瘤细胞内，随后小分子细胞毒素在胞内释放并杀伤肿瘤细胞，达到治疗作用。
每个抗体连接的小分子细胞毒素的平均值为药物抗体偶联比（Drug-to-antibody ratio, DAR），DAR值是ADC药物最重要的质量属性之一。低的DAR值会降低ADC药物的效力，高的DAR值又会影响ADC分析的药代动力学和毒性，所以对ADC药物进行DAR分析尤为重要[1]。ADC药物的DAR值会受不同偶联方式的影响，常见的偶联方式有半胱氨酸偶联、赖氨酸偶联和定点偶联，常用的DAR值分析方法有紫外可见分光光度法（UV-Vis）、反相色谱法（RP）、疏水作用色谱法（HIC）和质谱法（LC-MS）等。
1、紫外可见分光光度法（UV-Vis）
ADC药物的裸抗和小分子毒素最大吸收波长不同，紫外可见分光光度法（UV-Vis）可通过分别检测裸抗和小分子药物最大吸收波长下的吸光度, 根据各自的消光系数计算摩尔浓度，进而得到DAR值。
疏水作用色谱法（HIC）是根据ADC药物的疏水性进行分离。通过梯度变化降低流动相盐浓度，按照疏水性由低到高的顺序逐渐洗脱，药物连接的小分子毒素越多，疏水性越强，在色谱柱的保留时间越长。HIC法洗脱条件温和，可保持分子的天然状态，较适用于半胱氨酸偶联的ADC药物。通过半胱氨酸偶联可产生含有0-8个小分子毒素的DAR值种类，二硫键还原后可产生2个游离巯基，所以连接的小分子一般以偶数出现。HIC法不仅可以基于其疏水差异有效分离不同小分子数目的药物计算DAR值，还可以得到不同偶联个数的药物分布，计算平均DAR值。由于HIC法可以在天然条件下分离DAR种类，可以应用于样品纯化。虽然HIC法非常适用于ADC药物分析，但也有一定的缺陷，由于流动相为非挥发性盐而对质谱不兼容。
反相色谱法（RP）与HIC法分离原理相同，都是基于ADC药物的疏水性差异实现不同组分的分离。但反相色谱流动相中存在有机溶剂，使蛋白质变性，破坏二硫键。因此，采用反相色谱法，常在样品分析前用巯基乙醇充分还原，对携带不同数目小分子药物的LC和HC进行分离，也可用于天然ADC分离L、H、HH、HL和HHL片段，计算平均DAR值。因流动相中不含非挥发性盐，可通过质谱联用对各个组分进行鉴定，计算带有不同数目药物的轻重链比例，对于基于半胱氨酸偶联ADC的DAR及药物分布分析具有重要的借鉴意义。
质谱法可分为变性质谱法和天然质谱法，两种方法都是基于药物的分子量差异进行DAR值分析。质谱法适用于各种偶联方式的ADC药物，分析前通常需要额外的样品前处理以减少质谱的复杂度，常采用PNGase F酶去除ADC药物的N-糖糖基化和CpB酶去除C末端赖氨酸。质谱法可检测完整ADC分子，直接反应ADC药物的连接情况，通过各个峰面积百分比和各自携带小分子药物的数量得到加权平均DAR值。也可加入还原剂得到不同数目药物的重轻链的比例和DAR值。
赋成生物拥有自己的ADC偶联技术平台和与技术路线相对应的分析方法开发和质控平台，可针对ADC药物的不同偶联方式、不同的Linker和Payload，为客户提供定制化的DAR值检测和开发服务，下面为MMAE偶联ADC药物的开发实例▼
☑ 赋成生物承接的客户ADC项目，通过赋成生物偶联技术平台（半胱氨酸偶联方式）偶联小分子MMAE，并采用疏水作用色谱HIC法对具有相同Linker和Payload的市售ADC药物和赋成生物偶联ADC药物进行DAR检测，结果图谱和表明：与市售ADC药物相比，赋成生物偶联的ADC药物DAR4比例显著提高，药物分布更具有均一性。
参考文献
[1] 于传飞, 王文波, 武钢.一种基于半胱氨酸偶联的抗体偶联药物的药物抗体偶联比测定[J]. Chinese journal of New Drugs. 2015, 24(20): 2336-2340
[2] Yutaka Matsuda, Brian A. Mendelsohn. Recent Advances in Drug–Antibody Ratio Determination of Antibody–Drug Conjugates[J]. Chem. Pharm. Bull. 2021, 69(10): 976-983
