离子交换层析病毒清除的稳健性

通过离子交换层析清除病毒，可以提高治疗性蛋白产品的安全性。病毒清除的稳健性，取决于病毒与带相反电荷的层析介质之间的静电结合。然而，逆转录病毒异嗜性小鼠白血病病毒（XMuLV），即使在病毒和介质都带正电荷的情况下，其与介质之间的结合依然是稳健的。

该文献通过比较XMuLV和细小病毒的病毒-介质结合行为，来研究这种与正常预期相反的现象，这两类病毒在大小和结构上有很大差异，但是两者的等电点是相似的。当两类病毒都带负电时，XMuLV与带正电的阴离子交换介质的结合强度高于细小病毒。当两类病毒都带正电的时候，XMuLV与带正电的介质紧密结合，但是细小病毒是游离的。这些发现表明，XMuLV与填料的结合增强是通过局部电荷分布来实现的，细小病毒不具备这种特性，这种特性是设计层析工艺清除病毒稳健性能力的重要考量。

治疗性蛋白的生产通常采用阴离子流穿（FT-AEX）层析和阳离子结合洗脱（BE-CEX）层析纯化步骤。这些步骤主要是基于和层析介质之间不同静电相互作用的强度从产物中去除杂质和病毒。理论上，病毒-介质的相互作用会受到病毒等电点（pI）、溶液pH、溶液离子强度（离子浓度）、病毒上可结合位点的数量以及竞争分子等因素影响。目前报道的研究，证明了一些病毒清除的溶液影响因素，但是对病毒结构的影响知之甚少。

美国和欧洲的监管机构分析了申请者提交的病毒清除研究，观察到离子交换层析步骤具有显著的病毒清除潜力。大量的数据证实，在通常情况下使用强阴离子交换或弱阴离子交换层析，可以获得稳健的逆转录病毒清除效果，尤其是在上样pH足够高的条件下。对于BE-CEX，也有一致的逆转录病毒清除效果的报道。然而，目前还不清楚为什么小的、无包膜的细小病毒比大的、有包膜的逆转录病毒清除更不稳定且效果更差；为什么在pH 5的条件下，XMuLV和层析介质都带正电荷，XMuLV仍能与层析介质结合。因此在相同条件下比较有包膜的XMuLV与无包膜的细小病毒的病毒-介质结合方式，可能会得到新的启示。

本研究头对头分析了相同条件下不同模型病毒在FT-AEX和BE-CEX步骤的大量病毒清除数据。通过这些数据从病毒结构特征以及多角度的影响，揭示了电荷相互作用的机制，包括检测在不同上样pH、电导以及使用更高等电点的模型病毒条件下病毒的清除效果。除了静电相互作用外，该发现对病毒的结构特征引起的病毒与介质结合强度的差异进行了定性解释。

• ✔ 生产过程

本研究分析了60多个离子交换层析的病毒清除研究数据，以更好地了解驱动病毒清除的机制，并确定有利于稳健清除病毒的条件。简而言之，利用离心或深层过滤收集细胞培养料液，进行第一步亲和捕获层析。然后用低pH处理亲和产物来灭活包膜病毒。随后，采用经典的精纯纯化步骤进一步纯化蛋白，包括一步FT-AEX（精纯1）和一步BE-CEX（精纯2）。在某些情况下，FT-AEX作为精纯2步骤。最后进行病毒过滤、超滤置换及辅料添加制备原液。精纯1的产物中HCP残留是200 ng/mg，或者小于200 ppm，并且宿主细胞DNA低于检测限（<0.1 pg/mg）。与精纯2对比，精纯1的上样料液含有更多杂质，其HCP残留是精纯2上样料液的十倍以上。

• ✔ 缩小模型

使用缩小模型模拟生产条件进行病毒清除研究。缩小模型的关键参数是层析介质类型（填料或者膜）、柱高、起始料液的成分、流速、溶液成分（包括pH和电导）、溶液体积、温度、载量和产物收集标准。在多数情况下，基于层析特征、收率和产品质量来证明缩小模型的有效性。分析检测结果证明了产物质量与大规模生产的质量相当。检测方法包括：A_{280 nm}法检测总蛋白、酶联免疫法检测HCP、PCR法检测宿主细胞DNA、体积排阻色谱检测纯度（用单体和聚体的百分比来表示）。病毒spiking实验和鉴定试验使用相同的起始料液、层析柱和操作参数。三种阴离子填料和一种膜介质具有强阴离子交换剂的季胺基基团，一种阴离子填料具有强阴离子交换剂的聚乙烯亚氨基基团。阳离子填料具有强阳离子交换剂的硫丙基基团。

• ✔ 模型病毒和病毒测定

使用的六个模型病毒如表1所示，包括有包膜的异嗜性小鼠白血病病毒（XMuLV）、假狂犬病毒（PRV）和无包膜的病毒呼肠孤病毒3型（Reo3）、猿猴病毒40（SV40）、猪细小病毒（PPV）和小鼠细小病毒（MVM）。目前还没有文献报道PPV的pI。MVM和PPV这两个病毒在离子交换层析实验中，没有表现出明显的差异，在遗传上密切相关，具有相似的二十面体衣壳组装和大小，49%的蛋白质具有同源性，即使表面电荷分布略有不同，相比于XMuLV，他们之间的总体差异很小。为了方便与XMuLV进行比较，本研究将MVM和PPV的实验结果作为细小病毒类别进行综合分析，并在图中用不同的符号进行说明。实验中使用高纯度的病毒悬液，添加量通常是7-9 log₁₀，添加比例≤1%。

采用空斑测试或半数细胞培养物感染量（TCID₅₀）测定病毒清除研究中样品的病毒滴度。在空斑测试中，接种指示细胞并培养至合适的密度。对样品进行连续稀释、接种和孵育促使病毒复制。孵育结束后先计算空斑数，然后基于空斑数和起始样品体积计算病毒效价（pfu/mL）。在TCID₅₀测试中，接种指示细胞至96孔板并培养至合适的密度。对样品进行连续稀释、接种和孵育促使病毒复制。孵育结束后进行细胞病变效应分析，并采用Spearman-Karber法计算病毒滴度(TCID₅₀/mL)。所有实验均包括检测病毒的阴性和阳性对照实验。

此外，在病毒清除研究之前，对样品进行指示细胞的毒性测试和读数干扰测试，若发现样品浓度对实验结果有影响，则对样品进行适当的稀释来减小这些影响。在实验期间，将添加病毒后的上样样品保存在工艺温度下，作为病毒稳定性的对照，若其滴度低于上样样品，则用于计算log10降低值（LRV）。选择性地检测流穿、清洗和高盐Strip样品中的病毒分布情况，以更好地研究病毒清除机制。

• ✔ 病毒清除实验

病毒清除实验通过将测试病毒注入原始料液，经精纯步骤后，比较每个步骤前后的病毒数量来确定LRV。所有实验都是重复进行的，使用平均LRV进行分析，包括使用新、旧填料重复实验的情况。新、旧填料的LRV差异都小于1.0 log₁₀。只有在其他重复实验之间的差异超过1.0 log₁₀情况下，采用较低的LRV。

• ✔ 上样pH对FT-AEX层析清除病毒的影响

FT-AEX模式下，带正电的层析介质捕获带负电的杂质和假定的病毒，同时带正电的蛋白产品流穿。对于FT-AEX，评估了具有季胺基团或聚乙烯亚胺基团的强阴离子交换树脂，上样pH在5.3~8.2范围内，电导率< 11 mS/cm。产品pI > 7，在该实验条件下蛋白带正电。

XMuLV在上样pH 6.3~8.2范围内，平均LRV为5.9（n=24），其中16个实验组的病毒清除效果达到了检测限，只有1组LRV低于4（图1A，左）。在相同的pH范围内，细小病毒清除效果差异较大，平均LRV为5.2（n=24），其中18个实验组病毒LRV > 4.0（图1A，中），另外6组细小病毒LRV < 4.0，所有样品均来自精纯1工艺步骤（图1A，虚线框），表明早期步骤中的杂质可能与病毒竞争结合。此外，在相同条件下，细小病毒清除受溶液电导率的影响较大，而XMuLV清除受到其影响较小（图1C）。

当上样pH降低至5.3~6.1时，不管是低于或者接近病毒pI（XMuLV pI=5.8，假设PPV pI接近6.2），XMuLV的平均LRV为6.3，PPV的平均LRV仅有1.7（图1A，右）。对pI为7的单抗案例进行深入分析，将上样pH从5.3提高至6.4，PPV清除可以从LRV 1.9提高至LRV 5.9（图1D）。精纯2步骤的上样pH为5.3，初始料液的HCP < 5 ng/mg。精纯1步骤的上样pH为6.4，初始料液的HCP约为200 ng/mg。由于上样pH 6.4情况下LRV更高，这说明HCP的竞争结合不是这组数据的关键因素。一种可能的解释是，净正电荷阻止细小病毒与AEX介质结合，而净正电荷不足以阻止XMuLV与AEX介质结合。

• ✔ 膜层析FT-AEX清除病毒

当上样pH低于产品pI时，膜层析FT-AEX的季胺基基团清除病毒的趋势（图2）与层析柱FT-AEX相似（图1A）。上样pH在6.9和7.4以及5.0~6.3范围内，XMuLV清除都较为稳健（图2）。上样pH为6.9和7.4时，细小病毒的平均LRV是3.9（n=2）。上样pH在 5.0~6.3范围内，上样pH低于或接近病毒pI，细小病毒的清除效果较差。（图2，右，n=9，5 PPV_S，4 MVM_S）。

LRV多样性变化有多种潜在的原因，包括杂质或者产品的竞争以及加入病毒的纯度和质量。然而，这组数据来自精纯2步骤，其初始料液具有低HCP和低于检测限的DNA，除了A组中的一个案例来自精纯1步骤（在图2中用菱形符号表示）具有高LRV。产品带有正电荷，并且膜层析对这两种病毒具有相同的作用。这些结果和考量因素共同表明，病毒的电荷状态是结合的主要驱动力，XMuLV结合可能涉及更多的复杂性。

膜层析FT-AEX的LRV（图2）比层析柱（图1A）略低。但在特定的上样pH范围内比较，LRV趋势相似：高LRV的上样pH接近中性，低LRV的上样pH在5.0~6.3范围内。在蛋白不超载的情况下，三种病毒进行膜吸附和层析柱FT-AEX中观察到类似的LRV趋势。膜层析的蛋白结合超载，尤其是高杂质料液，可能导致细小病毒竞争加剧。在所有的案例中，XMuLV结合没有受到明显的影响，除非在本研究中上样pH明显高于产品pI（见下文）。

• ✔ 产物净电荷对膜层析FT-AEX清楚XMuLV的影响

有些情况下用FT-AEX纯化带负电荷的蛋白产物，尤其是低pI的蛋白。膜层析FT-AEX的结果表明，带负电荷的蛋白产物不利于清除XMuLV（图3，左，开放圆圈），可能是由于产物和病毒竞争结合位点。这与蛋白产物带正电荷时，具有较高LRV（多数> 4.0）形成反差（图3，右）。

• ✔ BE-CEX

在BE-CEX模式下，带正电荷的杂质、假设的病毒和蛋白产物结合到层析介质，同时带负电荷的的杂质流穿。然后产物在合适的盐浓度下被洗脱，在这个条件下杂质和病毒仍然结合在介质上。本研究中上样pH多在4.5~7.0范围内，接近5.0，但是所有的情况上样pH均低于蛋白pI，因此产品携带正电荷。

• ✔ 病毒类型对BE-CEX病毒清除的影响

BE-CEX的结果表明，XMuLV去除效果（n=24）是多变的，无细小病毒去除（n=7）效果（图4A）。7组案例中，其中3组XMuLV的LRV＞4.0，剩余4组LRV＜2.0.。在XMuLV稳健清除的案例中，病毒与填料紧密结合但未失活，其感染性可在高盐Stirp收集产物中恢复（图4B）。

• ✔ BE-CEX工艺条件对XMuLV清除的影响

可以根据上样pH、洗脱pH以及洗脱缓冲液的盐浓度对XMuLV清除效果进一步分组（图5）。上样pH约为5时，洗脱前清洗或者不清洗，使用中等盐浓度进行洗脱，可有效地实现XMuLV的稳健清除（图5A, n = 16）。pH 5.0下用较高的盐浓度洗脱时（n = 2），或在较高的pH（5.9-8.5）洗脱时（n = 6），XMuLV与产物会共洗脱，病毒清除效果显著降低（图5B）。XMuLV的清除依赖于洗脱pH和盐浓度，表明净电荷相互作用仍然是驱动病毒结合的关键动力，但这并不能解释细小病毒无法这样结合的原因。这些结果与之前BE-CEX的病毒清除结果基本一致。

• ✔ 病毒等电点对BE-CEX病毒清除效果的影响

如果静电相互作用是驱动病毒去除的关键因素，则可以预测在高洗脱pH条件下，BE-CEX能有效去除较高pI的病毒。PRV就是这样，它的pI是7.6。在pH 5.9-8.5的洗脱条件下，XMuLV、细小病毒、Reo 3和SV40的LRV均小于2.0，但PRV的LRV大于5.0（图6）。感染性检测表明，PRV与填料结合紧密，在产物环境中未被灭活（数据未显示）。

使用96孔高通量方式筛选最佳AEX参数时，观察到XMuLV在pH5时与AEX介质的结合与正常预期相反。本研究提供了全面的病毒清除数据，证实携带净正电的XMuLV确实可以与带正电的AEX介质高强度结合（图1和图2）。

使用粗粒度模型结合单个氨基酸突变体研究了带电表面的蛋白结合。结果表明，局部电荷或微环境区域对结合比整体蛋白净电荷更重要。正如最近使用结构照明显微镜和计算平均值所观察到的，病毒膜上的蛋白质是可移动的，并且能够形成功能簇。这些观察结果共同支持以下假设：XMuLV表面带负电荷的、局部的、潜在的可移动的蛋白可能是XMuLV与阳性AEX介质结合的原因。细小病毒没有膜，因此不具有这种特性。

XMuLV表面的糖基化蛋白可能发挥作用，在未来的研究中可以检测去糖基化的XMuLV结合模式。XMuLV的脂质膜形状多变、尺寸较大以及局部电荷分布都可能有助于通过长距离增强结合强度。相反，细小病毒体积较小、形状固定、没有脂质膜、没有糖基化蛋白，表明在电荷相互作用的背景下，细小病毒表现得与传统蛋白更为相似（图7）。

基于本研究的综合分析，在相同的FT-AEX条件下，相对于XMuLV，细小病毒展现出与层析介质更弱的结合能力。pI略高的细小病毒可能也有利于弱结合。比如，BE-CEX层析在上样pH5时，携带较少正电的XMuLV（pI~5.8）仍然能与CEX介质有较高的结合强度，在高盐状态下洗脱，与产品分离（图4B）。在相同的条件下，细小病毒携带更多的正电（pI~6.2）仍不能有效结合，因为它在流穿部分和洗脱产物部分被回收（数据未展示）。这些观察结果更能表明细小病毒的弱结合强度与结构有关，与净电荷无关。

在Protein A层析研究中，发现XMuLV与单抗体共结合和共洗脱，LRV一般在1~4 logs之间。相反，FT-AEX对XMuLV可实现稳健地清除，LRV高于4 logs。这表明病毒与产物共结合并与产物共洗脱，会造成更低的病毒清除效果。

表2总结了在本研究中稳健清除病毒的情况。与细小病毒相比，XMuLV表现出与层析介质更强的结合能力，更有利于病毒的稳健清除。XMuLV更大的外形和局部结构可以增加多样性的相互作用，类似于抗原-抗体相互作用的亲和作用概念。由于病毒-介质结合发生十分迅速，在结合能力限度内，相对于病毒结构和电荷状态，流速/保留时间和柱高等工艺参数对病毒清除的影响非常小。因此可以简化离子交换层析对病毒清除稳健性的预测。

XMuLV与填料结合强度很大，这也是因为，与细小病毒相比，XMuLV的清除几乎不受层析过程中杂质竞争的影响（比如，精纯1步骤的起始料液中存在酸性HCP）（图1A）。只有当病毒和产物具有相同的电荷状态时，XMuLV清除才会受到影响（图3），这种情况下，产物的数量可能超过杂质数量的几个数量级。因此，我们的数据进一步支持FT-AEX在上样pH7.0-8.5，电导率< 14 mS/cm时，平均LRV> 5.0。这些条件也适用于基于膜的FT-AEX层析（图2）。XMuLV在相同条件下，如果料液中存在少量竞争杂质，细小病毒也可以实现平均LRV> 5.0（图1A，中）。 

在相同的条件下，BE-CEX可以实现稳健的XMuLV清除效果，平均LRV> 4.0（图5）。另外，研究结果表明BE-CEX可以与FT-AEX互补清除病毒。比如，pI为8的细小病毒在上样pH接近7的情况下不能清除，但是通过BE-CEX可能会被清除（图6）。

离子交换层析对病毒的清除依赖于静电相互作用，但是病毒结构和大小会影响相互作用强度，影响工艺的稳健性。本研究证明FT-AEX、BE-CEX的单步层析或者两步联用，在特定的上样pH和电导率条件下，多种病毒可以被稳健地清除。

通过本研究可以识别并避免病毒清除能力降低的具体条件，从而在实践中采用上样pH在7.0~8.5范围内，电导率小于14 mS/cm的方法进行产品病毒安全风险评估，而不是传统的实验评估。从而也能够节省资源，用于实施综合策略，以最大限度地减少整体病毒污染风险。